신생흰쥐에서 분리된 심장근육세포와의 혼합배양에 의한 근육모세포의 분화유도에 대한 연구

• 영문명: Studies on Differentiation of Cardiac Myoblast Induced by Co-culture with Isolated Neonatal Rat Cardiac Myocytes
• 발행기관: 대한해부학회
• 저자명: 박정현(Jeong Hyun Park) 강한솔(Han Sol Kang)
• 간행물 정보: 『대한해부학회지』제37권 제1호, 19~30쪽, 전체 12쪽
• 주제분류: 의약학 > 의학일반
• 파일형태: PDF
• 발행일자: 2004.02.28

국문 초록

본 연구는 허혈성 심장질환에 대한 세포이식의 시험관내 모델을 개발하기 위하여 심장근육모세포주 H9c2 세포, 골격근육모세포주 L6 세포를 단독배양 혹은 심장근육세포와 혼합배양하여 심장근육세포로의 분화를 확인하고 심장분화와 관련된 전사인자인 MEF2c와 Nkx2.5의 과발현을 통하여 분화과정에서 관찰할 수 있는 세포사이결합의 형성, 동시박동 유무, 심장근육세포 분화 표지자를 확인하여 이들간의 상호관계를 규명하고자 계획하였다. 도립위상차현미경으로 관찰한 결과 MEF2c와 Nkx2.5에 의하여 형질전환을 시키는 경우 모든 종류의 세포에서 형태학적 인 변화를 나타내었다. 특히 H9c2-MEF2c, H9c2-Nkx2.5 세포는 길이가 길고 방추형을 취하며 심장근육세포와 유사한 모양 을 나타냈다. 심장근육세포로의 분화 여부를 확인하기 위해 cardiac troponin T의 분포를 확인한 결과 H9c2-Nkx2.5 세포에서 점(spot) 형태의 반응이 관찰되었다. 교통반점(gap junction)의 표식자인 connexin43을 면역형광염색한 결과 H9c2-MEF2c, H9c2-Nkx2.5, L6-MEF2c, L6-Nkx2.5 세포 등의 단일배양과 심장근육세포와의 혼합배양에서 모두 connexin43의 양이 증가하였다. 또한 L6-Nkx2.5 세포에서 특징적으로 교통반점과 부착반점이 형성되었다. 한편 박동수를 비교한 결과 H9c2-MEF2c, H9c2-Nkx2.5, L6-MEF2c, L6-Nkx2.5 등의 세포와 혼합배양한 심장근육세포에서 배양기간 동안 수축이 강하게 나타났고 박동이 규칙적이고 지속적으로 나타났으며 박동수도 유의하게 증가하였다. 그러나 심장근육세포를 제외한 모든 세포에서 능동적인 수축은 없었고 수동적인 이동만 관찰되었다. 저산소처리에 따른 세포손상 정도를 관찰한 결과 H9c2-MEF2c, L6-MEF2c, L6-Nkx2.5 세포에서 대조군에 비해 저산소에 대해 저항성을 갖는 것으로 나타났다. 결론적으로, 세포주의 종류에 다소 차이는 있지만 혼합배양과 전사인자 MEF2c와 Nkx2.5의 과발현에 의하여 심장근육세 포로 분화가 유도되었고, 심장근육세포와 혼합배양시 세포사이결합이 형성되었으며, 세포의 수축력도 유의하게 증가하였다. 또한 저산소 처리에 대한 강한 저항성을 나타내었다. MEF2c와 Nkx2.5의 과발현을 이용하여 세포이식모델을 구축한다면 허혈성 심장질환 환자를 위한 새로운 치료법이 될 것이다. 본 실험은 심장근육모세포의 세포이식에 관련된 연구에서 심장분화와 관련된 전사인자인 MEF2c와 Nkx2.5를 이용하는 연구에 기초자료가 될 것으로 사료된다.

영문 초록

Cellular cardiomyoplasty has recently emerged as a potential new treatment of ischemic heart disease. Combining cellular cardiomyoplasty with gene therapy using myogenic transcription factor might facilitate myocardial regeneration. In this study, we engineered H9c2, L6 using plasmid vector to overexpress the transcription factor MEF2c, Nkx2.5 involved in cardiomyogenesis. We investigated 1) formation of intercellular junction in mono-culture and co-culture with cardiomyocyte for functional and structural synchronous contraction after transplantation, 2) differentiation into cardiomyocyte, 3) resistance to hypoxic condition. Each cell overexpressing MEF2 and Nkx2.5 was generated by gene transfection and clonal selection. CO-culture was performed that each cell line added over cultured cardiomyocyte. H9c2-MEF2c and H9c2-Nkx2.5 became long, spindle shape like cardiomyocyte. Troponin T, cardiac specific marker, was found spot-like pattern in H9c2-Nkx2.5. However, co-culture with cardiomyocyte did not induce differentiation all kinds of cells into cardiomyocyte. Connexin43, which is gap junction marker was increased in H9c2-MEF2c, H9c2-Nkx2.5, L6-MEF2c and L6-Nkx2.5. Especially, co-culture with cardiomyocyte resulted in elevation of connexin43 levels more than monoculture. Ultrastructurally, formations of gap junction and desmosome were found apparently in L6-Nkx2.5. Long-standing, strong, regular and more frequent contraction were observed in cardiomyocyte co-cultured with H9c2-MEF2c, H9c2- Nkx2.5, L6-MEF2c, L6-Nkx2.5, respectively. Neverthless, any cell did not have active contraction itself, but passive movement except cardiomyocyte. H9c2-MEF2c, L6-MEF2c and L6-Nkx2.5 had resistance to hypoxia compared with other groups. These results suggested that co-culture and overexpressions of MEF2c and Nkx2.5 induced differentiation into cardiomyocyte and played an important role on intercellular junction formation and hypoxic resistance. This would be a promising source of cellular cardiomyoplasty. Therefore, much more research would be essential for clinical application of cellular cardiomyoplasty and this study would be a basic source for further study of MEF2c and Nkx2.5 in cellular cardiomyoplasty.

키워드

심장근육세포 근육모세포 MEF2c Nkx2.5 세포이식술 세포사이결합 Cardiomyocyte Myoblast MEF2c Nkx2.5 Cell transplantation Intercellular junction