이온화 방사선에 의한 TIMP1 , TIMP2 유전자 발현 측정

• 영문명: Expression of TIMP1, TIMP2 Genes by Ionizing Radiation
• 발행기관: 대한방사선종양학회
• 저자명: 박건구(Kun-Koo Park) 진정선(Jung Sun Jin) 박기영(Ki Yong Park) 이연희(Yun Hee Lee) 김상윤(Sang Yoon Kim) 노영주(Young Ju Noh) 안승도(Seung Do Ahn) 김종훈(Jong Hoon Kim) 최은경(Eun Kyung Choi) 장혜숙(Hyesook Chang)
• 간행물 정보: 『대한방사선종양학회지』제19권 제2호, 171~180쪽, 전체 10쪽
• 주제분류: 의약학 > 종양학
• 파일형태: PDF
• 발행일자: 2001.06.30

국문 초록

목 적 :Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP)는 matrix metalloproteinase (MMP)에 작용하여 암세포의 침윤과 전이를 억제하고 염증, angiogenesis, fibros is에 중요한 역할을 한다. TIMP 유전자는 여러 cytokine 및 signal molecule에 의하여 조절되는 유전자이므로 방사선에 의한 TIMP의 발현을 측정하고 전사 조절 기전을 연구하고자 하였다. 대상 및 방법 :두경부암 환자의 병변에서 유도하여 확립한 두경부암 세포주를 이용하여 방사선에 의한 TIMP 유전자 발현을 측정하였다. 각 세포주의 방사선 민감도를 측정하고 transwell을 이용한 invasion assay로 전이성을 측정하였다. TIMP1, TIMP2 발현은 conditioned medium을 취해 ELISA assay로 측정하였다. 방사선조사는 2 Gy, 10 Gy군으로 나누어 관찰했고 조사 후 시간 간격은 24, 48시간이었다. MTT assay로 생존세포 수를 측정하여 방사선 세포치사로 인한 발현 변화를 보정하였다. hTIMP1 promoter region을 PCR하여 pGL2- basic luciferase reporter vector에 cloning하여 인간 두경부암 세포주에 이입하여 functional TIMP1 발현이 증가하는지 확인하였고 protein kinase C(PKC) activator인 PMA (phorbol 12-myristate 13- acetate)와 Ras에 의한 TIMP1 발현이 유도되는지 확인하였다. 결 과 :HN- 1, HN-2, HN-3, HN-5, HN-9 세포주의 D0는 각각 1.55 Gy, 1.8 Gy, 1.5 Gy, 1.55 Gy, 2.45 Gy 이었다. 각 세포주의 방사선조사 후 MTT assay에 의한 cell viability는 24, 48시간에서 2 Gy인 경우 모두 94% 이상 그리고 10 Gy에서는 73% 이상의 생존 세포를 확인하였다. TIMP1, TIMP2 단백의 basal 농도는 24시간 48시간에서 점점 증가하여 세포에서 계속 합성되어 분비되고 있음을 확인하였다. 2 Gy 조사 후 24시간에서 TIMP2는 HN- 1, HN-9 세포주에서 감소하였으나, 10 Gy 조사 후에는 두 세포주에서 모두 증가하여 방사선량에 따라 반응이 달랐고, 방사선조사 후 48시간에는 HN- 1세포주에서는 증가하나 HN-9 세포주에서는 감소하여 세포주에 따라 반응이 달랐다. 그러나 방사선에 의한 TIMP1 발현 변화는 미미하였다. TIMP1 reporter gene을 인간 두경부암 세포주에 transfection하고 PMA (100 ng/ml)을 가한 경우 HN- 1세포주에서는 유의하게 증가하고 HN-9 세포주에서는 감소하였다. Ras 발현 벡터와 co- transfection한 경우 TIMP1 promoter가 활성화 되었다. 결 론 :모두 두경부 암에서 유래된 세포주 이지만 방사선에 의한 TIMP의 발현 및 전사조절 기전은 세포주 마다 차이가 있었고 이온화 방사선의 용량에 따라서, 방사선조사 후의 시간 경과에 따라서도 TIMP 발현에 차이가 있었 다. 이 결과는 TIMP의 전사 및 발현이 여러 종류의 signal molecule에 의하여 영향을 받고, 이 signal molecule들이 각 세포주 마다 다르기 때문으로 사료된다.

영문 초록

Purpose : Express ion of TIMP, intrins ic inhibitor of MMP, is regulated by s ignal transduction in response to genotoxins and is likely to be an important step in metastas is , angiogenes is and wound healing after ionizing radiation. Therefore, we studied radiation mediated TIMP express ion and its mechanism in head and neck cancer cell lines . Materials and Me thods : Human head and neck ca ncer cell lines established at Asan Medical Center were used and radiosens itivity (D0), radiation cytotoxicity and metastatic potential were measured by clonogenic assay, MTT assay and invas ion assay, respectively. The conditioned medium was prepared at 24 hours and 48 hours after 2 Gy and 10 Gy irradiation and express ion of TIMP protein was measured by Elisa assay with specific antibodies against human TIMP. hTIMP1 promotor region was cloned and TIMP1 luciferase reporter vector was constructed. The reporter vector was transfected to AMC- HN- 1 and-HN-9 cells with or without express ion vector Ras , then the cells were exposed to radiation or PMA, PKC activator. EMSA was performed with oligonucleotide (- 59/- 53 element and SP1) of TIMP1 promotor. Results : D0 of HN- 1, - 2, - 3, - 5 and - 9 cell lines were 1.55 Gy, 1.8 Gy, 1.5 Gt, 1.55 Gy and 2.45 Gy respectively. MTT assay confirmed cell viability, over 94% at 24hrs , 48hrs after 2 Gy irradiation and over 73% after 10 Gy irradiation. Elisa assay confirmed that cells secreted TIMP1, 2 proteins continuous ly. After 2 Gy irradiation, TIMP2 secretion was decreased at 24hrs in HN- 1 and HN- 9 cell lines but after 10 Gy irradiation, it was increased in all cell lines . At 48hrs after irradiation, it was increased in HN- 1 but decreased in HN-9 cells . But the cha nge in TIMP secretion by RT was mild. The transcription of TIMP1 gene in HN- 1 was induced by PMA but in HN-9 cell lines , it was suppressed. Wild type Ras induced the TIMP- 1 transcription by 20 fold and 4 fold in HN- 1 and HN- 9 respectively. The binding activity to - 59/- 53, AP1 motif was increased by RT, but not to SP1 motif in both cell lines . Conclusions :We observed the difference of expresson and activity of TIMPs between radiosens itive and radiores istant cell line and the different s ignal transduction pathway between in these cell lines may contribute the different radiosens itivity. Further research to investigate the radiation response and its s ignal pathway of TIMPs is needed.

키워드

TIMP Gene regulation 두경부암 방사선 TIMP Gene regulation Head and neck cancer Radiation